Golgi lahir di Córteno Golgi, provinsi Brescia, Italia. Ayahnya adalah seorang dokter dan petugas kesehatan daerah tersebut. Golgi belajar ilmu kedokteran di Universitas Pavia, di mana ia bekerja dalam percobaan laboratorium patologi bersama Giulio Bizzozero, tokoh yang menjelaskan sumsum tulang. Golgi lulus pada 1865. Ia banyak menghabiskan masa kariernya dengan meneliti sistem saraf pusat.
Ketika bekerja sebagai kepala petigas kedokteran di sebuah rumah sakit jiwa, ia mencoba memasukkan logam pada jaringan saraf, terutama dengan logam perak (pengotoran perak atau silver staining). Ia menemukan sebuah metode pengotoran jaringan saraf yang akan mengotorkan beberapa sel secara acal. Hal ini membuatnya dapat mengamati jalur-jalur pada sel-sel saraf di otak untuk pertama kalinya. Ia menyebut penemuannya sebagai "reaksi hitam" (dalam bahasa Italia: reazione nera). Metode ini dikenal sebagai metode Golgi atau pengotoran Golgi. Alasan mengapa terjadi pengotoran acak masih belum dapat dijelaskan. Beliau juga yang menemukan badan golgi.
Golgi juga menemukan organ sensorik tendon yang nantinya disebut reseptor Golgi. Ia mempelajari siklus hidup dari Plasmodium falciparum dan membandingkan masa demam yang terjadi pada pasien malaria dengan siklus hidup organisme ini. Dengan menggunakan teknik pengotorannya, Golgi berhasil mengidentifikasi sebuah bagian dalam sel pada 1898. Bagian itu sekarang dikenal sebagai benda Golgi.
Golgi dan Santiago Ramón y Cajal menerima pada Hadiah Nobel dalam Fisiologi atau Kedokteran pada tahun 1906 untuk penelitiannya mengenai sistem saraf.
Golgi meninggal di Pavia, Italia, pada Januari 1926.